მასალები და მეთოდები
მასალები
ხილის მწიფობის პერიოდში შეგროვილი ვაშლის, შავქლიავას და ატმის სხვადასხვა ჯიშის ნიმუშები.
საქართველოს სხვადასხვა რეგიონიდან ხილის მიკრობული მრავალფეროვნების შესწავლა კულტურაზე დაფუძნებული მეთოდებით
რძემჟავა ბაქტერიების და საფუვრების იზოლატების გამოყოფა ვაშლის, შავქლიავას და ატმის ნაყოფებიდან ტარდებოდა კულტურაზე დაფუძნებული მეთოდით ხილის მწიფობის პერიოდში. რძემჟავა ბაქტერიების იზოლატები გამოიყოფოდა MRS- და M17- აგარზე, ხოლო საფუვრები -WLN აგარზე. ცალკეული კოლონიები მიიღებოდა სერიული განზავების მეთოდით. ინკუბაციის ხანგრძლივობა, ტემპერატურა და აერაციის პირობები შეირჩეოდა გამოყოფილი მიკროორგანიზმების მიხედვით. იზოლატების მრავალჯერადი გადათესვისა და პირველადი სკრინინგის საფუძველზე მიიღებოდა სუფთა კულტურები.
კულტურების ხანგრძლივად შესანახად, თერმოსტატში 37 °C-ზე გაზრდილი 24-სთ-იანი კულტურების გადატანა ხდებოდა წინასწარ გასტერილებულ 1 მლ გლიცეროლის შემცველ 2 მლ-იან კრიოსინჯარებში და თავსდებოდა ღრმა გაყინვის საყინულეში -80˚C-ზე.
მიკროორგანიზმთა კოლონიებისა და უჯრედების მორფო-ფიზიოლოგიური და ბიოქიმიური შესწავლა
რძემჟავა ბაქტერიების უჯრედების მორფოლოგიიის შესწავლა ხდებოდა კოლონიის ფორმის მიხედვით და უჯრედის მიკროსკოპირებით. შესწავლილ იქნა მათი ზრდა სხვადასხვა pH-ზე (2.0, 4.0, 6.4, 7.2) და ტემპერატურაზე (4 °C, 10 °C, 37 °C, 45 °C). ამ მიზნით, საკვები არეების გასტერილების შემდეგ, ერთი მხრივ, მოხდა მათი pH-ის შემცირება 2.0-ამდე და 4.0-ამდე, შესამცირებლად გამოყენებულ იქნა 1N HCl, გადასათეს მასალად კი - 24 სთ-იანი ინოკულატი. ინკუბაცია მიმდინარეობდა 37 °C-ზე ანაერობულ პირობებში 48 სთ-ის განმავლობაში. ბიოქიმიური მახასიათებლის შესასწავლად, რძემჟავა ბაქტერიები იზრდებოდა ნახშირწყლების სხვადასხვა წყაროზე. ამ მიზნით, იზოლატების ერთდღიანი კულტურა გადაიტანებოდა Phenol red ბულიონში, რომელშიც თავსდებოდა დარემის სინჯარა (Durham tubes). ნახშირბადის წყაროს (გალაქტოზა, ქსილოზა, მალტოზა, სორბიტი, ინოზიტი, მანიტი, გლუკოზა, ფრუქტოზა, საქაროზა) შეტანა ხდებოდა 1%-ის ოდენობით.
იზოლატების პრობიოტიკული თვისებების შესწავლა: ნაღვლის მარილების მიმართ ტოლერანტობა და ანტიმიკრობული აქტივობა პათოგენური შტამების მიმართ
იზოლატების პრობიოტიკული თვისებებიდან შესწავლილ იქნა მათი ზრდის უნარი ნაღვლის მარილების სხვადასხვა კონცენტრაციის (0.3, 0.5, 1.0 %) შემცველ საკვებ არეზე არეზე (Tambekar და Bhutada, 2010).
ერთ-ერთი ყველაზე მნიშვნელოვანი პრობიოტიკული თვისების, პათოგენური შტამების მიმართ LAB-ის იზოლატების ანტიმიკრობული აქტივობის გამოყენებული იყო აგარში დიფუზიის მეთოდი. კვლევა ჩატარდა შემდეგ პათოგენურ შტამებზე: Salmonella enterica ATCC 14028, Bacillus cereus ATCC 1087, Proteus mirabilis ATCC 12453, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Shigella flexneri ATCC 12022, Escherichia coli ATCC 25922 (Egorov, 1965).
ანტიბიოტიკების მიმართ მგრძნობელობის შეფასება
ანტიბიოტიკების მიმართ მგრძნობელობა ფასდებოდა დისკის დიფუზიის მეთოდით. გამოყენებული იყო 14 ანტიბიოტიკი: ციპროფლოქსაცინი 5 მკლ, ერითრომიცინი 15 მკგ, ბაციტრაცინი 10 ერთეული, ტეტრაციკლინი 30 მკგ, სტრეპტომიცინი 10 მკგ, ნეომიცინი 10 მკგ, ქლორამფენიკოლი 30 მკგ, ტილოზინი 30 მკგ, გენტამიცინი 10 მკგ, ამპიცილინი 5 მკგ, ვანკომიცინი 5 მკგ, ნალიდიქსის მჟავა 30 მკგ, სტრეპტომიცინი 30 მკგ, კანამიცინი 30 მკგ. MRS აგარზე გადატანილ იქნა 24 სთ-იანი საკვლევი სუფთა კულტურები გაზონის სახით და 30 წთ-ის შემდეგ მათზე მოთავსდა ანტიბიოტიკის დისკები. პეტრის ჯამების 37 °C-ზე 24-48 სთ-იანი ინკუბაციის შემდეგ იზომებოდა ანტიბიოტიკების დისკების ირგვლივ იზოლატების ინჰიბირების ზონის დიამეტრები. შესწავლილი ინოკულანტები კლასიფიცირდა როგორც რეზისტენტული (R, ზონის დიამეტრი ≤14 მმ), შუალედური (I, ზონის დიამეტრი 15-19 მმ) ან მგრძნობიარე (S, ზონის დიამეტრი ≥20 მმ) (Kim et al., 2021).
იზოლატების იდენტიფიკაცია 16S და 26S რიბოსომული დნმ-ის მიხედვით
შერჩეული იზოლატების მოლეკულური იდენტიფიკაციისთვის დნმ-ის ექსტრაქცია მოხდა მოხარშვის მეთოდის (Dashti et al., 2009) მცირედი მოდიფიკაციით, რაც გულისხმობს წყლის ნაცვლად TE ბუფერის (Invitrogen) გამოყენებას და დუღილის ტემპერატურად 100 °C-ს (95 °C-ის ნაცვლად). მოცემულ კვლევაში, რძემჟავა ბაქტერიების დნმ-ის 16S rRNA გენის უბნის ამპლიფიკაციისთვის გამოყენებულ იქნა Lactobacillus casei-ს სახეობა-სპეციფიკური პრაიმერები: LCgF - 5’ATCATGGAATTGATGGATACCA3’ და LCgR - 5’TAGACTTGATAACATCTGGCTT3’, Lc3 - 5’ GCGGACGGGTGAGTAACACG3’ და Lc4 - 5’ GCTTACGCCATCTTTCAGCCAA3’ (Furet et al., 2004; Sheu et al., 2009).
მულტიპლექსური პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) ჩატარდა GenePro თერმოციკლერის გამოყენებით (Bioer, ჩინეთი). 1X მასტერმიქსი (25 მკლ) შეიცავდა 12.5 მკლ 2 x PCR BIO-ს, 1 მკლ LCgF პრაიმერს, 1 მკლ LCgR პრაიმერს, 1 მკლ Lc3 პრაიმერს, 1 მკლ Lc4 პრაიმერს, 6.5 მკლ ddH2O-ს და 2 მკლ საკვლევი იზოლატის დნმ-ის ნიმუშს. დადებით კონტროლად გამოყენებულ იყო Lactobacillus casei ATCC 393-ის და Lactobacillus paracasei ATCC 334-ის დნმ-ის იგივე რაოდენობები. სარეაქციო ნარევის ამპლიფიკაციისთვის გამოყენებულ იქნა თერმოციკლერი შემდეგი ეტაპებით: ინიციაციის ფაზა - გაცხელება 94 °C-ამდე 5 წთ-ის განმავლობაში, დენატურაციის ფაზა - გაცხელების რეაქციის 35-ჯერ განმეორებით 94 °C-ზე 35 წმ, ჰიბრიდიზაციის ფაზა - 55 °C-ზე 35 წმ, ელონგაციის ფაზა - 72 °C-ზე 40 წმ, ფინალური ელონგაცია - 72 °C-ზე 7 წთ და საბოლოო ფაზა - 4 °C-ზე (Sheu et al., 2009). ასევე გამოყენებული იყო Lactobacillus plantarum-ის სახეობა-სპეციფიკური პრაიმერი: LbP11 - 5’AATTGAGGCAGCTGGCCA3’ და LbP12 - 5’GATTACGGGAGTCCAAGC3’ (Quere, 1997). PCR ჩატარდა GenePro თერმოციკლერით (Bioer, ჩინეთი). 1X მასტერმიქსი (25 მკლ) შეიცავდა 12.5 მკლ 2 x PCR BIO-ს, 1 მკლ LbP11 პრაიმერს, 1 მკლ LbP12 პრაიმერს, 8.5 მკლ ddH2O-ს და 2 მკლ საკვლევი იზოლატის დნმ-ის ნიმუშს. დადებით კონტროლად გამოყენებულ იყო Lactobacillus plantarum ATCC 14917-ის დნმ-ის იგივე რაოდენობა. უარყოფითი კონტროლი შეიცავდა მხოლოდ 2 მკლ დეიონიზებულ წყალს. სარეაქციო ნარევის ამპლიფიკაციისთვის გამოყენებული იყო თერმოციკლერი შემდეგი ეტაპებით: ინიციაციის ფაზა - გაცხელება 95 °C-ამდე 5 წთ-ის განმავლობაში, დენატურაციის ფაზა - გაცხელების რეაქციის 45-ჯერ განმეორებით 94 °C-ზე 30 წმ, ჰიბრიდიზაციის ფაზა - 54 °C-ზე 1 წთ, ელონგაციის ფაზა 72 °C-ზე 1 წთ, ფინალური ელონგაცია 72 °C-ზე 10 წთ და საბოლოო ფაზა - 4 °C-ზე (Furet et al., 2004; Sheu et al., 2009). PCR ფრაგმენტების ანალიზი ჩატარდა 2%-იან აგაროზის გელში 1 x TAE ბუფერში ეთიდიუმის ბრომიდით შეღებვის შემდეგ, ვიზუალიზაცია განხორციელდა UV-ტრანსილუმინატორით. ხილიდან მიღებული სუფთა იზოლატები იდენტიფიცირებული იყო სახეობა-სპეციფიკური PCR-ით.
ატმის და შავქლიავას წვენის მომზადება
ატმის (Prunus persica) და შავქლიავას (Prunus domestica subsp. domestica) ნიმუშები შეგროვდა საქართველოს სხვადასხვა რეგიონში, სიმწიფის ფაზაში. ხილი გაირეცხა და Bosch-ის წვენსაწურის გამოყენებით (გერმანია) გამოწურული წვენები ცალ-ცალკე გაიფილტრა მარლაში. ნატურალური წვენები 250 მლ-ის ოდენობით ჩამოისხა კოლბებში, რის შემდეგაც გასტერილდა 121˚C-ზე 15 წთ-ის განმავლობაში და მოთავსდა მაცივარში 4˚C-ზე (Mandha et al., 2023).
საწყისი მიკრობული კულტურის მომზადება
ხილის ნაყოფების კანიდან ჩვენ მიერ გამოყოფილი რძემჟავა ბაქტერიების პრობიოტიკული თვისებებზე (Gagelidze et al., 2024) დაყრდნობით შეირჩა 4 შტამი (Lactobacillus casei G51, Lactobacillus casei G91, Lactobacillus plantarum G99 და Lactobacillus plantarum G101), რომლებიც ინახებოდა 50% გლიცეროლი/50% MRS-ში -80˚C-ზე. შტამები ხელახლა გააქტიურდა MRS აგარზე, სამჯერადი გადათესვით. გაცოცხლებული სამუშაო შტამების თითოეული კოლონია გადატანილი იყო MRS ბულიონის 2 მლ-იან სინჯარებში, თერმოსტატში 37 ˚C-ზე 48 სთ განმავლობაში. წვენებში ფერმენტაციისათვის შესატანი ცალკეული შტამები კულტივირებული იყო 15 მლ-იან MRS ბულიონის სინჯარებში.
იზოლატების ურთიერთდამოკიდებულების შესწავლა
კონსორციუმის შექმნის მიზნით შესწავლილი იყო LAB-ის იზოლატების ურთიერთდამოკიდებულება აგარში დიფუზიის მეთოდით. MRS აგარზე გაზრდილი თითოეული იზოლატის (72 სთ-იანი) ბლოკები თავსდებოდა პეტრის ფინჯნებზე, რომლებზეც ჩათესილი იყო ის იზოლატები, რომელთა ურთიერთდამოკიდებულებაც შეისწავლებოდა. იზოლატების ურთიერთდამოკიდებულება ფასდებოდა აგარის ბლოკის ირგვლივ ინჰიბირების მიხედვით, 37 °C-ზე 48 საათის განმავლობაში ანაერობული ინკუბაციის შემდეგ (Tkesheliadze 2023).
ხილის წვენების ფერმენტაცია
რძემჟავა ბაქტერიების 48 სთ-იანი კულტურები გამოვიყენეთ კონსორციუმის 2 ვარიანტის, კონსორციუმი I-ის: Lactobacillus casei G91+Lactobacillus plantarum G99 და კონსორციუმი II-ს: Lactobacillus casei G51+Lactobacillus plantarum G101 შესაქმნელად. წინასწარ მომზადებულ 250-250 მლ ატმისა და შავქლიავას წვენებში შეტანილი იყო თითოეული კონსორციუმის 1.0×107 კწე/მლ სუსპენზია, საფერმენტაციო არეში მისი საბოლოო 5%-იანი კონცენტრაციით. ფერმენტაცია ჩატარდა ინკუბატორში (Memmert IN260) 37 ˚C ტემპერატურაზე 3 დღის განმავლობაში.
ფერმენტირებულ ხილის წვენებში სიცოცხლისუნარიანი უჯრედების რაოდენობის დადგენა
უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობაზე და ფიზიკურ-ქიმიურ თვისებებზე ცივად შენახვის ზეგავლენის დასადგენად, შესაბამისი ფერმენტაციის დროის (3 დღე) დასრულების შემდეგ, ფერმენტირებული წვენის ნიმუშები შესანახად გადაგვქონდა 4˚C ტემპერატურაზე 35 დღის განმავლობაში. ფერმენტირებულ წვენებში ფიზიკურ-ქიმიური მაჩვენებლები და სიცოცხლისუნარიანი უჯრედების რაოდენობა აღირიცხებოდა ფერმენტაციის შემდეგ (3 დღე) და მაცივარში შენახვის პერიოდში (მე-4, მე-7, მე-14, 21-ე, 28-ე და 35-ე დღეს). მიკრობული პოპულაცია გამოხატული იყო კწე/მლ-ის სახით.
სიცოცხლისუნარიანი უჯრედების რაოდენობა მიიღებოდა სერიული განზავების მეთოდით: 107 განზავების ინოკულატის 0.1 მლ-ის ჩათესვით MRS აგარზე, სამჯერადი განმეორებით. პეტრის ჯამების ინკუბაცია მიმდინარეობდა 48-72 სთ-ის განმავლობაში 37 ˚C-ზე ანაერობულ პირობებში. ჯამები, რომლებიც შეიცავდა 20-350 კოლონიას ითვლებოდა და აღირიცხებოდა როგორც კოლონიის წარმომქმნელი ერთეული (კწე/მლ) (Hashemi et al., 2017, ISO/TS 19036, 2006).
ბაქტერიოსტატიკური აქტივობის დასადგენად ასევე იზომებოდა ბაქტერიული სუსპენზიის ოპტიკური სიმღვრივე სპეტროფოტომეტრზე (OD600 ნმ) (Tarifa et al., 2023).
ფიზიკურ-ქიმიური და ბიოქიიური ანალიზი
pH-ის და ტიტრული მჟავიანობის განსაზღვრა
ექსპერიმენტის ყველა ეტაპზე იზომებოდა pH-ის მნიშვნელობა ციფრული Jenway 3510 Standard Digital pH-მეტრით, ხოლო ტიტრული მჟავიანობა (T˚) ისაზღვრებოდა სტანდარტული მეთოდით (Barrón-Álvarez et al., 2022). მონაცემები გამოხატულ იქნა გ/ლ-ზე.
შაქრების საერთო შემცველობის განსაზღვრა
შაქრების რაოდენობა შავქლიავასა და ატმის წვენებში ისაზღვრებოდა ფერმენტაციამდე, ასევე ორი სხვადასხვა კონსორციუმით 3-დღიანი ფერმენტაციის შემდეგ და მაცივარში გადატანიდან მე-14 და 35-ე დღეს (GOST 8756.13-87, 2010). შედეგები გამოხატულ იქნა გ/ლ-ში.
გლუკოზის, ფრუქტოზის და ორგანული მჟავების განსაზღვრა
ფრუქტოზის და გლუკოზის კონცენტრაციები შავქლიავასა და ატმის წვენებში ისაზღვრებოდა ფერმენტაციამდე, ასევე ორი სხვადასხვა კონსორციუმით 3-დღიანი ფერმენტაციის შემდეგ და მაცივარში გადატანიდან მე-14 და 35-ე დღეს მაღალი ეფექტურობის თხევადი ქრომატოგრაფის (Varian ProStar HPLC) საშუალებით; გამოყენებული იყო RID დეტექტორი, Shrodex Sugar SH 1011 ქრომატოგრაფიული სვეტი (300 მმ × 8 მმ), ელუენტი - 0.01 N H3PO4. ქრომატოგრაფიული სვეტის ტემპერატურა - 60 °C. იმავე ნიმუშებში ისაზღვრებოდა ორგანული მჟავების (რძემჟავა, ვაშლმჟავა, ლიმონმჟავა და ქარვამჟავა) კონცენტრაცია მაღალი ეფექტურობის თხევადი ქრომატოგრაფით (Varian ProStar HPLC), გამოყენებული იყო UV-დეტექტორი λ=210 nm, Eurospher II 100-3 C18H ქრომატოგრაფიული სვეტი (250 მმ × 3 მმ), ელუენტები: A - 1.96 გ/ლ H2SO4 და B - მეთანოლი. ქრომატოგრაფიული სვეტის ტემპერატურა - 60 °C. ცალკეული შაქრებისა და ორგანული მჟავების რაოდენობა გადაანგარიშებულ იქნა გ/ლ-ზე.
ჯამური ფენოლების შემცველობის განსაზღვრა
ჯამური ფენოლების რაოდენობა შავქლიავასა და ატმის წვენებში კოლორიმეტრულად ისაზღვრებოდა ფერმენტაციამდე, ასევე ორი სხვადასხვა კონსორციუმით 3-დღიანი ფერმენტაციის შემდეგ და მაცივარში გადატანიდან მე-14, 21-ე, 28-ე და 35-ე დღეს (Box et al., 1983). სტანდარტული მრუდის ასაგებად გამოყენებული იყო გალის მჟავა 0.03 გ/ლ.
ანტიოქსიდანტური აქტივობის განსაზღვრა
ანტიოქსიდანტური აქტივობა შავქლიავასა და ატმის წვენებში ისაზღვრებოდა სპექტროფოტომეტრულად FRAP-ის მეთოდით ფერმენტაციამდე, ასევე ორი სხვადასხვა კონსორციუმით 3-დღიანი ფერმენტაციის შემდეგ და მაცივარში გადატანიდან მე-14, 21-ე, 28-ე და 35-ე დღეს. მონაცემები ისაზღვრებოდა მგ-ში (ასკორბინის მჟავას ეკვივალენტი (AAE) წვენის 1 ლ-ში) (Osiripun et al., 2021).
სტატისტიკური ანალიზი
მიღებული მონაცემები დაექვემდებარა დისპერსიულ ანალიზს, p>0.05 ნდობის ალბათობის დონით. Tukey ტესტი გამოყენებული იყო საშუალო მნიშვნელობების შესადარებლად p>0.05 ალბათობის დონეზე.
პროგრამული უზრუნველყოფა შესრულდა R 4.1.2-ით (R Core Team, 2016), AgroR 1.3 პაკეტის Cran R, 2022 (Shimizu et al., 2021) გამოყენებით.
ბიბლიოგრაფია
Barrón-Álvarez N, Prado-Barragán L A, Fortis-Barrera MDL Á, & Alarcon-Aguilar FJ (2022) Fermentation of the Cucurbita ficifolia Fruit Juice: Its Antioxidant Activity and Effects on the Glycemia. Beverages, 8(3), 55.
Box, J. D. (1983). Investigation of the Folin-Ciocalteau phenol reagent for the determination of polyphenolic substances in natural waters. Water research, 17(5),
Dashti A., Jadaon M., Abdulsamad A., Dashti H. (2009). Heat treatment of bacteria: a simple method of DNA extraction for molecular techniques. Kuwait Medical Journal, 41(2): 117-122.
Egorov NS (1965) Microbe antagonists and biological methods of determining antibiotic activity. Microbe antagonists and biological methods of determining antibiotic activity.
Furet, J. P., Quénée, P., & Tailliez, P. (2004). Molecular quantification of lactic acid bacteria in fermented milk products using real-time quantitative PCR. International journal of food microbiology, 97(2), 197-207.
Gagelidze N., Tkesheliadze E., Varsimashvili Kh., Tinikashvili L., Tolordava L., Sadunishvili T. (2024). Studying the Probiotic Potential of Lactic Acid Bacteria of Fruits Common in Goergia to obtain Functional Juices, 17th International Scientific Conference on Probiotics, Prebiotics, Gut Microbiota and Health – IPC2024, 18-20 June
GOST 8756.13-87; State Standard of the Russian Federation. Fruit and Vegetable Products. Methods for Determination of Sugars. GOST: Moscow, Russia, 2010; p. 11. (In Russian).
Hashemi S. M. B., Mousavi K. A., Barba F. J., Nemati Z., Sohrabi S. S., Alizadeh F. (2017), Fermented sweet lemon juice (Citrus limetta) using Lactobacillus plantarum LS5: Chemical composition, antioxidant and antibacterial activities, Journal of Functional Foods, 38, pp. 409–414, DOI: 10.1016/j.jff.2017.09.040.
Kim, H., Shin, M., Ryu, S., Yun, B., Oh, S., Park, D. J., & Kim, Y. (2021) Evaluation of probiotic characteristics of newly isolated lactic acid bacteria from dry-aged hanwoo beef. Food Science of Animal Resources, 41(3), 468.
Mandha, J., Shumoy, H., Matemu, A. O., & Raes, K. (2023). Characterization of fruit juices and effect of pasteurization and storage conditions on their microbial, physicochemical, and nutritional quality. Food Bioscience, 51, 102335.
Osiripun, V., & Apisittiwong, T. (2021). Polyphenol and antioxidant activities of Kombucha fermented from different teas and fruit juices. Journal of Current Science and Technology, 11(2), 188-196.
Quere, F., Deschamps, A., & Urdaci, M. C. (1997). DNA probe and PCR‐specific reaction for Lactobacillus plantarum. Journal of Applied Microbiology, 82(6), 783-790.
Sheu, S. J., Hwang, W. Z., Chen, H. C., Chiang, Y. C., & Tsen, H. Y. (2009). Development and use of tuf gene–based primers for the multiplex PCR detection of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei group, Lactobacillus delbrueckii, and Bifidobacterium longum in commercial dairy products. Journal of food protection, 72(1), 93-100.
Tarifa, M. C., del Rosario Agustín, M., & Brugnoni, L. I. (2023). Biological control of foodborne pathogens by lactic acid bacteria: A focus on juice processing industries. Revista argentina de microbiología, 55(4), 378-386.
Tambekar DH, & Bhutada SA (2010) An evaluation of probiotic potential of Lactobacillus sp. from milk of domestic animals and commercial available probiotic preparations in prevention of enteric bacterial infections. Recent Research in Science and Technology, 2(10), 82-88.
Tkesheliadze E. (2023). Dissertation thesis, Development of Probiotic Compositions for Apple Juice Production, Agricultural University of Georgia (in Georgian).
გვერდის დასაწყისი
